Warum ist dieses Wissen wichtig? Haben sich zwei homologe Proteine, d. h. solche, die von einem gemeinsamen Vorfahren abstammen, bereist sehr weit voneinander entfernt, ist ihre Verwandtschaft über Sequenzvergleich nicht mehr nachweisbar. Der Vergleich der Strukturen lässt diese Verwandtschaft jedoch noch erkennen.

Ein klassischer Ansatz zum Strukturvergleich ist im Programm Dali umgesetzt, dass Sie hier kennenlernen.
Bezug Die theoretischen Grundlagen finden Sie im Kapitel 19 "Vergleich von Protein-3D-Strukturen".  

Lernziel
Nach dem Bearbeiten der Übung sollten Sie
  • Dali anwenden,
  • Ergebnisse von Superpositionsexperimenten interpretieren

können.

 
   
Übung 3D_Vergl_1 Superposition von (beta-alpha)8-Fässern
 
Das (βα)8-Fass, das wir bereits kennengelernt haben, ist ein häufig verwendetes Strukturgerüst. Es sind bisher mehr als 80 Proteinstrukturen gelöst, die als Grundmotiv dieses Barrel enthalten. Wir haben uns diese Supersekundärstruktur bereits mehrfach angesehen.

Diesen Faltungstyp weisen auch die Triosephosphate Isomerase von Thermotoga maritima (PDB-Code 1b9b) und die 2-Deoxyribose-5-Phosphat Aldolase (1p1x) von Escherichia coli auf.
 
Weisen Sie die Homologie der beiden Strukturen nach.
 
 
Paarweiser Sequenzvergleich Besorgen Sie sich zuerst die Sequenzen der jeweiligen Ketten A der PDB-Datensätze.
Geben Sie im Suchfeld der PDB-Datenbank die Codes 1b9b bzw. 1p1x ein und benutzen Sie die Funktion Download Files/FASTA Sequence, um die Sequenzen zu sichern.
  
BLAST Vergleichen Sie nun die Sequenzen paarweise mittels BLAST (bl2seq und anschließender Wahl von blastp)

Findet BLAST homologe Bereiche?		  
  Um die Empfindlichkeit zu steigern, könnten Sie auf PSI-BLAST auszuweichen.
  
Smith-Waterman Benutzen Sie nun das EMBOSS-Tool zum Alignieren zweier Sequenzen.

Wählen Sie EMBOSS:water, um lokale Alignments zu berechnen. Da die Suche möglichst empfindlich sein soll, wählen Sie bitte als Matrix die BLOSUM 40 aus.

Wird ein lokales Alignment gefunden? Wie gut ist dessen Qualität?

Beachten Sie bei Ihrer Interpretation die Anzahl identischer Residuen und den Anteil von Lücken, die in das Alignment eingefügt wurden.		  
     
Vergleich der Strukturen mit DALI Obige Analysen haben gezeigt, dass die Sequenzähnlichkeit keinen sicheren Schluss auf die Homologie der Protein zulässt. Der Vergleich der Strukturen sollte jedoch Klarheit schaffen.

Eines der anerkannt besten Verfahren zum Vergleich von Strukturen ist DALI, das den paarweisen Vergleich von Strukturen erlaubt.

Geben Sie in den Feldern First Structure und Second Structure die PDB-Codes 1b9b bzw. 1p1x ein und wählen Sie jeweils die Kette A. Stoßen Sie anschließend den Vergleich durch Anklicken der Taste submit an.

Es wird Ihnen eine Seite Results errechnet, die eine Liste mit signifikanten strukturellen Alignments (Z-Score > 2) enthält.
  
     
Superposition der Strukturen Wählen Sie den ersten Eintrag in der Summary und klicken Sie dann auf die Taste 3D Superposition. In einem separaten Fenster wird die Superposition gezeigt.

Verwenden Sie Ihre Jmol-Kenntnisse, um die Strukturen nach Ihren Wünschen darzustellen.

Ist dieses Ergebnis überzeugender als das Sequenzalignment?

  
  Klicken Sie anschließend auf die Taste  Structural Alignment.

Vergleichen Sie Sequenz- und Strukturalignment.
Wie gut stimmt die Abfolge der 2D-Elemente überein?		  

Was Sie jetzt verstanden haben sollten

 Proteine können sich auf Sequenzniveau bereits soweit voneinander entfernt haben, dass die Homologie nicht mehr nachweisbar ist. Der Vergleich der Strukturen erlaubt jedoch häufig, diese Verwandtschaft noch nachzuweisen. Der Vergleich von Supersekundärstrukturelementen und der 3D-Struktur ist die Grundlage für Klassifikationssysteme wie die SCOP-Datenbank.