Lernziel
Nach dem Bearbeiten der Übung
sollten Sie
können. |
Diese Übung orientiert sich an den beiden Arbeiten DelPal96 und WatTab97.
Ribulose 1,5-biphosphate (RuBP) Carboxlyase/Oxygenase (RubisCO) ist zweifelsohne das auf der Welt am weitesten verbreitete Enzym. Es kommt in zwei unterschiedlichen Strukturformen (Form I und Form II) vor. Das Form I Enzym besteht aus acht kleinen und acht großen Untereinheiten. Das Enzym mit Form II besteht nur aus großen Untereinheiten, die allerdings völlig anders aufgebaut sind als die der Form I. Die Bedeutung des Enzyms liegt darin, dass es aufgrund der weiten Verbreitung massiv in die Kohlenstoff-Fixierung eingreift. Insbesondere im Hinblick auf die globale Erwärmung ist es wichtig, Funktion, Verbreitung und Evolution dieses Enzyms genau zu verstehen.
Die Gene rbcL und cbbL sowie die daraus resultierenden Proteinsequenzen eignen sich gut für phylogenetische Studien, da die Sequenzen einer Vielzahl von Spezies bekannt sind. Während Stammbäume, die von DNA-Sequenzen der rbcL Gene gut übereinstimmen mit solchen, die aus 16S rRNA abgeleitet wurden, zeichnen Bäume abgeleitet von RbcL-Proteinsequenzen ein ganz anderes Bild. Diesen Vergleich sollen Sie hier nachvollziehen.
| Entwickeln Sie einen Stammbaum der
Proteinsequenzen von RbcL. Was schließen Sie für die Herkunft von RubisCo in Cyanobakterien? |
2) Benutzen Sie CLUSTALW für das multiple Sequenzalignment.
3) Generieren Sie phylogenetische Bäume mit der Neighbor-Joining Methode und Kimura Distanzen. Benutzen Sie Bootstrapping, um die Stabilität der Bäume zu evaluieren.
Vergleichen Sie Ihre Befunde mit solchen aus PubMed.
Beantworten Sie bitte folgende Fragen:
Wie groß ist die mittlere Geschwindigkeit der Genübertragung in kBasen/Jahr?
Wie vielen Genen entspricht dies?
Welchen Prozentsatz von Genen hat E. coli seitdem aufgenommen?
Thiol-Reduktion mithilfe des Thioredoxin- und des Glutathion-Systems spielt eine zentrale Rolle bei einer Vielzahl biologischer Funktionen wie z.B. bei der Apoptosis (dem Zelltod). Das Thioredoxin-System besteht aus mehreren Proteinen, die über ein System von active sites interagieren, in denen Cystein-Reste eine wichtige Rolle spielen.
Thioredoxin selbst ist ein kleines Protein, mit zwei redox-aktiven Cystein-Residuen im aktiven Zentrum (Cys-Gly-Por-Cys). Es interagiert mit NADPH und Thioredoxin Reduktase als höchst effizientes Reduktionssystem für exponierte Disulfide.
Die folgenden Frage beziehen sich zunächst auf das Thioredoxin H von Chlamydomonas reinhardtii. Besorgen Sie sich den PDB-File mit der zugehörigen Struktur.
| Die a-helix, die von den Residuen 37-52 gebildet wird, ist an einer Stelle unterbrochen. Welche Aminosäure würden Sie aufgrund der Eigenschaften vermuten? |
Es gibt mehrere Isoformen von Thioredoxin. Stellen Sie einen Datensatz zusammen, der die Sequenzen zu den folgenden Proteinen enthält: Cytosolisches (2 Isoformen) und mitochondriales Thioredoxin von S. cervisiae, Thioredoxin aus E. coli (aus zwei unterschiedlichen Genen stammend) und humanes Thioredixin cytosolischen und mitochondrialen Ursprungs.
| Welche Residuen sind in allen, welche in eukaryotischen Proteinen konserviert? |
Ergänzen Sie die Datei um eine Zeile, in der Sie die Sekundärstruktur eintragen.
| An welchen Stellen gibt es turns, ohne dass in den entsprechenden Bereichen des MSAs oder in der Nähe Insertionen/Deletionen auftreten. |
Überprüfen Sie, ob Ihr MSA den BLOSUM-80 Kriterien genügt.
Falls
nicht, ändern Sie es entsprechend ab. Bearbeiten Sie die folgenden
Fragen mit diesem Profil.
Die Positionsangaben beziehen sich auf diejenigen, die im PDB-File
1THX zu finden sind.
| Welches Hexapeptid kommt im MSA an den Positionen
28-33 am häufigsten
vor?
Welchen Score hat dieses Hexapeptid im Vergleich mit VLVYFW? |
Leiten Sie aus dem MSA ein Profil ab für die Positionen 101-106.
Bitte initialisieren Sie die Matrix zur Berechnung der Häufigkeiten nicht mit 0, sondern mit 1. (Weshalb?) Verwenden Sie für mittlere Aminosäurehäufigkeiten hier (ausnahmsweise) die entsprechenden Werte, die in der SwissProt-Datenbank angegeben sind. Welche würde man korrekterweise nehmen?
| Berechnen Sie den Score für die Sequenz KDKLLL im Vergleich mit Ihrem Profil. |
Generieren Sie eine Sequenz AEI für die Positionen 9-18. Klassifizieren Sie hierfür die Residuen nach dem folgenden Alphabet:
| Symbol | Bedeutung | Menge von Aminosäuren |
| a | ambivalent | = { Ala, Cys, Gly, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr } |
| e | extern | = { Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys } |
| i | intern | = { Ile, Leu, Met, Phe, Val } |
Falls Sie dazu in der Lage sind:
aufgaben
| Schreiben Sie Programme, die a) aus einem MSA ein Profil ableiten.
b) Eine Eingabesequenz mit diesem Profil vergleicht. |
Überlegen Sie sich, wie das Programm mit Lücken umgehen soll.
| Wie lauten die Einträge zu dieser Struktur in der SCOP- und CATH-Datenbank? |
Was sind die nächsten Verwandten? Generieren Sie unter Verwendung von DALI bzw. der FSSP-Database ein Strukturalignment von Thioredoxin (1fb0A) und Calsequestrin.
| Wie groß ist der Anteil identischer Aminosäuren? Ist das Strukturaligment plausibel? |
| Bestimmen Sie, wie viele Gene von A. thaliana die einzelnen Formen codieren. |
| Gibt es Motive, mit denen die drei Formen charakterisiert werden können? |
| Wie ist die Intron/Exon Struktur der Formen? |
Können Sie einen Algorithmus formulieren? Welche der Ihnen bekannten Tools können Sie nutzen?
Tragen diese Eigenschaften zur weiteren Charakterisierung bei?
Untersuchungen
Wir haben die Proteinsequenzen, die wir aus dem DOTLET-Paket bereits kennen, schon mit FASTA/BLAST ausgewertet. Wir wollen nun mehr über die Domänen- und 2D- bzw. 3D-Struktur erfahren. Es folgen nochmals drei ausgewählte Sequenzen.
| MS2_HUMAN (P78325) |
|
MRGLGLWLLGAMMLPAIAPSRPWALMEQYEVVLPRRLPGPRVRRALPSHLGLHPERVSYVLGATGHNFTLHLRKNRDLLG SGYTETYTAANGSEVTEQPRGQDHCLYQGHVEGYPDSAASLSTCAGLRGFFQVGSDLHLIEPLDEGGEGGRHAVYQAEHL LQTAGTCGVSDDSLGSLLGPRTAAVFRPRPGDSLPSRETRYVELYVVVDNAEFQMLGSEAAVRHRVLEVVNHVDKLYQKL NFRVVLVGLEIWNSQDRFHVSPDPSVTLENLLTWQARQRTRRHLHDNVQLITGVDFTGTTVGFARVSAMCSHSSGAVNQD HSKNPVGVACTMAHEMGHNLGMDHDENVQGCRCQERFEAGRCIMAGSIGSSFPRMFSDCSQAYLESFLERPQSVCLANAP DLSHLVGGPVCGNLFVERGEQCDCGPPEDCRNRCCNSTTCQLAEGAQCAHGTCCQECKVKPAGELCRPKKDMCDLEEFCD GRHPECPEDAFQENGTPCSGGYCYNGACPTLAQQCQAFWGPGGQAAEESCFSYDILPGCKASRYRADMCGVLQCKGGQQP LGRAICIVDVCHALTTEDGTAYEPVPEGTRCGPEKVCWKGRCQDLHVYRSSNCSAQCHNHGVCNHKQECHCHAGWAPPHC AKLLTEVHAASGSLPVLVVVVLVLLAVVLVTLAGIIVYRKARSRILSRNVAPKTTMGRSNPLFHQAASRVPAKGGAPAPS RGPQELVPTTHPGQPARHPASSVALKRPPPAPPVTVSSPPFPVPVYTRQAPKQVIKPTFAPPVPPVKPGAGAANPGPAEG AVGPKVALKPPIQRKQGAGAPTAP |
| SLIT_DROME (P24014) |
|
MAAPSRTTLMPPPFRLQLRLLILPILLLLRHDAVHAEPYSGGFGSSAVSSGGLGSVGIHIPGGGVGVITEARCPRVCSCT GLNVDCSHRGLTSVPRKISADVERLELQGNNLTVIYETDFQRLTKLRMLQLTDNQIHTIERNSFQDLVSLERLDISNNVI TTVGRRVFKGAQSLRSLQLDNNQITCLDEHAFKGLVELEILTLNNNNLTSLPHNIFGGLGRLRALRLSDNPFACDCHLSW LSRFLRSATRLAPYTRCQSPSQLKGQNVADLHDQEFKCSGLTEHAPMECGAENSCPHPCRCADGIVDCREKSLTSVPVTL PDDTTDVRLEQNFITELPPKSFSSFRRLRRIDLSNNNISRIAHDALSGLKQLTTLVLYGNKIKDLPSGVFKGLGSLRLLL LNANEISCIRKDAFRDLHSLSLLSLYDNNIQSLANGTFDAMKSMKTVHLAKNPFICDCNLRWLADYLHKNPIETSGARCE SPKRMHRRRIESLREEKFKCSWGELRMKLSGECRMDSDCPAMCHCEGTTVDCTGRRLKEIPRDIPLHTTELLLNDNELGR ISSDGLFGRLPHLVKLELKRNQLTGIEPNAFEGASHIQELQLGENKIKEISNKMFLGLHQLKTLNLYDNQISCVMPGSFE HLNSLTSLNLASNPFNCNCHLAWFAECVRKKSLNGGAARCGAPSKVRDVQIKDLPHSEFKCSSENSEGCLGDGYCPPSCT CTGTVVACSRNQLKEIPRGIPAETSELYLESNEIEQIHYERIRHLRSLTRLDLSNNQITILSNYTFANLTKLSTLIISYN KLQCLQRHALSGLNNLRVVSLHGNRISMLPEGSFEDLKSLTHIALGSNPLYCDCGLKWFSDWIKLDYVEPGIARCAEPEQ MKDKLILSTPSSSFVCRGRVRNDILAKCNACFEQPCQNQAQCVALPQREYQCLCQPGYHGKHCEFMIDACYGNPCRNNAT CTVLEEGRFSCQCAPGYTGARCETNIDDCLGEIKCQNNATCIDGVESYKCECQPGFSGEFCDTKIQFCSPEFNPCANGAK CMDHFTHYSCDCQAGFHGTNCTDNIDDCQNHMCQNGGTCVDGINDYQCRCPDDYTGKYCEGHNMISMMYPQTSPCQNHEC KHGVCFQPNAQGSDYLCRCHPGYTGKWCEYLTSISFVHNNSFVELEPLRTRPEANVTIVFSSAEQNGILMYDGQDAHLAV ELFNGRIRVSYDVGNHPVSTMYSFEMVADGKYHAVELLAIKKNFTLRVDRGLARSIINEGSNDYLKLTTPMFLGGLPVDP AQQAYKNWQIRNLTSFKGCMKEVWINHKLVDFGNAQRQQKITPGCALLEGEQQEEEDDEQDFMDETPHIKEEPVDPCLEN KCRRGSRCVPNSNARDGYQCKCKHGQRGRYCDQGEGSTEPPTVTAASTCRKEQVREYYTENDCRSRQPLKYAKCVGGCGN QCCAAKIVRRRKVRMVCSNNRKYIKNLDIVRKCGCTKKCY |
| SERA_PLAFG (P13823) |
|
MKSYISLFFILCVIFNKNVIKCTGESQTGNTGGGQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGSSEPSNPVSSGHSVSTVSV SQTSTSSEKQDTIQVKSALLKDYMGLKVTGPCNENFIMFLVPHIYIDVDTEDTNIELRTTLKETNNAISFESNSGSLEKK KYVKLPSNGTTGEQGSSTGTVRGDTEPISDSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSESLPANGPDSPTVKP PRNLQNICETGKNFKLVVYIKENTLIIKWKVYGETKDTTENNKVDVRKYLINEKETPFTSILIHAYKEHNGTNLIESKNY ALGSDIPEKCDTLASNCFLSGNFNIEKCFQCALLVEKENKNDVCYKYLSEDIVSNFKEIKAETEDDDEDDYTEYKLTESI DNILVKMFKTNENNDKSELIKLEEVDDSLKLELMNYCSLLKDVDTTGTLDNYGMGNEMDIFNNLKRLLIYHSEENINTLK NKFRNAAVCLKNVDDWIVNKRGLVLPELNYDLEYFNEHLYNDKNSPEDKDNKGKGVVHVDTTLEKEDTLSYDNSDNMFCN KEYCNRLKDENNCISNLQVEDQGNCDTSWIFASKYHLETIRCMKGYEPTKISALYVANCYKGEHKDRCDEGSSPMEFLQI IEDYGFLPAESNYPYNYVKVGEQCPKVEDHWMNLWDNGKILHNKNEPNSLDGKGYTAYESERFHDNMDAFVKIIKTEVMN KGSVIAYIKAENVMGYEFSGKKVQNLCGDDTADHAVNIVGYGNYVNSEGEKKSYWIVRNSWGPYWGDEGYFKVDMYGPTH CHFNFIHSVVIFNVDLPMNNKTTKKESKIYDYYLKASPEFYHNLYFKNFNVGKKNLFSEKEDNENNKKLGNNYIIFGQDT AGSGQSGKESNTALESAGTSNEVSERVHVYHILKHIKDGKIRMGMRKYIDTQDVNKKHSCTRSYAFNPENYEKCVNLCNV NWKTCEEKTSPGLCLSKLDTNNECYFCYV |
| Bestimmen Sie Zusammensetzung und Abfolge der Proteindomänen in diesen Proteinen |
Legen Sie eine Datei an, in der Sie in einer Zeile unter der Sequenz die Domänen kennzeichnen, z.B. wie in
MAAPSRTTLMPPPFRLQLRLLILPILLLLRHDAVHAEPYSGGFGSSAVSSGGLGSVGIHIPGGGVGVITEARCPRVCSCT
------- Domänenname --------
| Bestimmen Sie die Sekundärstruktur der Proteine. |
| Vergleichen Sie Domänen- und Sekundärstruktur. |
Legen Sie eine Datei an, in der Sie in einer Zeile unter der Sequenz die Domänen kennzeichnen, z.B. wie in
MAAPSRTTLMPPPFRLQLRLLILPILLLLRHDAVHAEPYSGGFGSSAVSSGGLGSVGIHIPGGGVGVITEARCPRVCSCT
------- Domänenname -------- .......
HHHHHHH SSSSSSSSS HHHHHHH .......
| Bestimmen Sie die 3D-Struktur. |
Falls dies der Fall sein sollte:
Extrahieren Sie die Sekundärstruktur und vergleichen Sie diese mit der
Vorhersage.
Falls dies nicht der Fall ist:
Suchen Sie einen Server, der die Tertiärstruktur vorhersagt (Stichwort
Homologoemodellierung) und lassen Sie die 3D-Struktur vorhersagen.
| Stellen Sie für jedes Protein sämtliche Ergebnisse in einer Datei zusammen. |
| Suchen Sie nach Homologen zum menschlichen PAX-6 Protein |
>PAX6_HUMAN MQNSHSGVNQLGGVFVNGRPLPDSTRQKIVELAHSGARPCDISRILQVSNGCVSKILGRYYETGSIRPRA IGGSKPRVATPEVVSKIAQYKRECPSIFAWEIRDRLLSEGVCTNDNIPSVSSINRVLRNLASEKQQMGAD GMYDKLRMLNGQTGSWGTRPGWYPGTSVPGQPTQDGCQQQEGGGENTNSISSNGEDSDEAQMRLQLKRKL QRNRTSFTQEQIEALEKEFERTHYPDVFARERLAAKIDLPEARIQVWFSNRRAKWRREEKLRNQRRQASN TPSHIPISSSFSTSVYQPIPQPTTPVSSFTSGSMLGRTDTALTNTYSALPPMPSFTMANNLPMQPPVPSQ TSSYSCMLPTSPSVNGRSYDTYTPPHMQTHMNSQPMGTSGTTSTGLISPGVSVPVQVPGSEPDMSQYWPR LQ |
Wählen Sie unter Program Selection zunächst PSI-BLAST
Ändern Sie dann unter Algorithm parameters den Werte
Max target
sequences auf 1000.
Klicken Sie nun auf BLAST, um die erste Runde anzustoßen. Im
Ergebnisfenster werden die Treffer angezeigt.
Starten Sie weitere Runden, indem Sie jeweils auf die GO-Taste drücken.
Mit
werden
jeweils die Sequenzen markiert, die in der vorhergehenden Runde zusätzlich
gefunden wurden.
Nachdem Sie fünf Runden ausgeführt haben, suchen Sie unter den Treffern den ersten zu einer Drosophila-Art.
| Ist der Treffer statistisch signifikant? |
| In welchen Arten kommt dieses Protein überhaupt vor? |
Nennen Sie einige Phyla, in denen Homologe des Proteins vorkommen.
| Lassen sich Ihre Befunde in der Literatur bestätigen? |
Wählen Sie auf der Seite mit den Treffern den Reiter Review.
Wählen Sie den Artikel von SI Tomarev und klicken Sie auf das Feld FreeFullText. Öffnen Sie die PDF-Datei und studieren Sie KURZ den Inhalt. Klicken Sie auf das Icon Free Full Text.
| Welche Schlüsse ziehen Sie aus Ihren Befunden und der Literatur? |
Aus einem PSI-BLAST-Lauf wurden Sequenzen übernommen, die in dieser Datei zusammengefasst sind.
Unterschiede in den Sequenzen werden deutlich, wenn wir die Sequenzen in ein multiples Sequenzalignment aufnehmen. Eines der anerkannt besten Verfahren ist T-Coffee und seine Varianten.
| Erstellen Sie ein multiples Sequenzalignment mithilfe von T-Coffee. |
Ändern Sie bei den Optionen die
Order zu aligned und stoßen Sie dann das Programm an,
indem Sie auf Submit klicken.
Ziehen Sie das Fenster soweit nach unten auf, dass Sie alle Sequenzen sehen können und ändern Sie die Farben mit Colour/Percentage Identity.
| Wie unterscheiden sich die einzelnen Proteine? |
Weshalb ist es sinnvoll, mehrere Drosophila-Sequenzen auszuwerten?
Wie interpretieren Sie die Unterschiede am Proteinanfang?
Weshalb ist der Genanfang der humanen Isoformen gleich, bei Rattus jedoch unterschiedlich?
Benutzen Sie einen der Server, um mit ProtPars einen phylogenetischen Baum zu erzeugen. Übergeben Sie dem Server das von T-Coffee erzeugte MSA im Phylip-Format, alternativ finden Sie hier das MSA-Format.
Starten Sie anschließend das Programm.
| Wo werden die Sequenzen aus dem menschlichen
Genom eingeordnet, wo die von Drosophila? Welche Spezies liegt extrem? Interpretieren Sie hierfür den besten Baum. |
Welcher Ansatz wurde bei der Berechnung des Baumes verwendet?
Bitte übergeben Sie per copy and paste die folgende Sequenz, geben Sie eine gültige Email-Adresse an und submitten Sie den Auftrag.
Je nach Auslastung kann es länger dauern, bis Ihr Job bearbeitet ist. Er wird Ihnen per Email zugestellt.
>Drosophila_melanogaster MMLTTEHIMHGHPHSSVGQSTLFGCSTAGHSGINQLGGVYVNGRPLPDSTRQKIVELAHSGARPCDISRI LQVSNGCVSKILGRYYETGSIKPRAIGGSKPRVATTPVVQKIADYKRECPSIFAWEIRDRLLSEQVCNSD NIPSVSSINRVLRNLASQKEQQAQQQNESVYEKLRMFNGQTGGWAWYPSNTTTAHLTLPPAASVVTSPAN LSGQADRDDVQKRELQFSVEVSHTNSHDSTSDGNSEHNSSGDEDSQMRLRLKRKLQRNRTSFSNEQIDSL EKEFERTHYPDVFARERLADKIGLPEARIQVWFSNRRAKWRREEKMRTQRRSADTVDGSGRTSTANNPSG TTASSSVATSNNSTPGIVNSAINVAERTSSALVSNSLPEASNGPTVLGGEANTTHTSSESPPLQPAAPRL PLNSGFNTMYSSIPQPIATMAENYNSSLGSMTPSCLQQRDAYPYMFHDPLSLGSPYVSAHHRNTACNPSA AHQQPPQHGVYTNSSPMPSSNTGVISAGVSVPVQISTQNVSDLTGSNYWPRLQ |
Versuchen Sie die Ausgabe zu verstehen.
Wie hoch ist der Erwartungswert für das beste Modell?
Welche Struktur wurde als Grundlage für die Modellierung verwendet?
Welche weiteren Informationen liefert Ihnen die Ausgabe?
Diese Datei wurde für diese Übung adaptiert.
Benutzen Sie die Maus, um das Modell zu rotieren und machen Sie sich den prinzipiellen Aufbau des Proteins klar.
| Wie wechselwirkt der Transkriptionsfaktor mit der DNA? |
Um obige Frage zu beantworten, sollten Sie im Block Images und Visualization den Link Jmol anklicken.
Benutzen Sie wiederum die Maus, um die Struktur zu bewegen. Können Sie die DNA identifizieren? In diesem Datensatz sind mehrere, an die DNA gebundene Transkriptionsfaktoren zu sehen. Diese sind in unterschiedlichen Farben eingefärbt.
Unterscheiden sich die Proteinstrukturen? Achten Sie insbesondere auf die Linker-Regionen.
Vergleichen Sie bitte auch die Strukturen von PAX 5 (in der PDB-Datenbank deponiert) und dem Modell von PAX 6 (Phyre-Vorschlag). Erscheint das Modell plausibel?
Das Fenster erlaubt die Manipulation einzelner Residuen. Die nächsten Befehle beziehen sich alle auf Operationen im Control Panel.
Klicken Sie auf den Namen des ersten Residuums. Es ist nun selektiert, was Sie an der roten Markierung sehen können. Klicken Sie anschließend direkt neben dem Eintrag in das Feld labl. Wie sie in der 3D-Darstellung sehen können, ist das erste Residuum ist nun mit einem Label (Marke versehen). Tun Sie das gleiche für das letzte Residuum.
Welche Nummern tragen diese Positionen des Modells?
Vergleichen Sie diese Positionen mit der Länge der Eingabesequenz aus dem obigen Feld:
Wie lange ist die Eingabesequenz?
Wie viele der Residuen enthält das Modell?
Was schließen Sie hieraus für die Funktion von Phyre und die
Übereinstimmung von PAX5 und PAX6?
Lassen Sie sich nun die Proteinoberfläche berechnen. Wählen Sie Tools/Compute Molecular Surface und interpretieren Sie das Ergebnis.
| Lässt sich die Hypothese, dass (βα)8-Fässer durch mehrfache Genduplikation entstanden, durch Auswertung der Sequenz/Struktur erhärten? |
1) Entscheiden Sie sich, nachdem Sie die Struktur ausgewertet haben, für eines der Proteine.
2) Sammeln Sie mittels BLAST ähnliche Sequenzen. Besorgen Sie sich parallel zu den Proteinsequenzen auch die der DNA.
3) Generieren Sie ein multiples Sequenzalignment. Seien Sie hier bitte sehr sorgfältig und benutzen Sie CLUSTAL und T-Coffee.
4) Tragen Sie im multiplen Sequenzalignment die Sekundärstruktur des Proteins ein.
5) Gibt es Muster, die auf Genduplikation schließen lassen? Vergleichen Sie sowohl Protein- als auch DNA-Sequenz der Hälften und kleinerer Strukturelemente.
Vergleichen Sie Ihre Ergebnisse mit denen dieser Arbeit von J. Söding.
Was Sie jetzt verstanden haben sollten